四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝,化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐.四唑盐比色法的原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝色产物——甲瓒(formazan),并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色的结晶物，溶液颜色的深浅与所含甲瓒量成正比.再用酶标仪测定OD值。

四唑盐(MTT)比色法的详细操作步骤如下：

1、接种细胞

(1)用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。

(2)离心细胞悬液,使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。

(3)将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。

(4)用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞。

(5)将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照。

(6)将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物。

2、添加药物

(7)用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。

(8)对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列各孔的培养基。

(9)在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。

(10)在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。

(11)向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。

(12)将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间。

3、生长期

(13)在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。

(14)每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。

4、存活细胞数的估算

(15)在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。

(16)用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4 h。

(17)弃去孔中的培养基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲�结晶。

(18)在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液(每孔25μl)。

(19)立即在570nm处记录吸光值。读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。

5、分析

以药物浓度为横坐标(X轴)，吸光值为纵坐标(Y轴)绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。

6、注意事项：

(1)细胞接种浓度：一般情况下,96孔培养板的每一个孔内当细胞长满时约有105个,但不同细胞贴壁后所占面积差异很大,所以,进行MTT实验前,应先对某种细胞测试贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,然后确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间.这样可保证终止培养时不致细胞过满,使MTT结晶与细胞数呈良好的线性关系.

(2)为避免血清干扰,一般选用低于10%的胎牛血清的培养液进行实验;

(3)由于培养基中血清、酚红影响测定孔的光吸收值,降低实验的敏感性,因此在呈色后应尽量吸尽孔内残余培养液;

(4)悬浮型生长的细胞要小心地去除培养液;

(5)设空白对照孔：实验中设不加细胞只加培养基的孔为空白对照孔,其他操作与实验组相同.最后比色时以空白对照孔调零。

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